[28 апреля] Международная онлайн-конференция «EdTech педагога-практика» Подтвердить участие→
Конкурс разработок «Пять с плюсом» апрель 2021
Добавляйте свои материалы в библиотеку и получайте ценные подарки
Конкурс проводится с 1 апреля по 30 апреля

Презентация "Метод Полимеразной цепной реакции(ПЦР)"

ПЦР – метод амплификации, т.е. получения большого числа копий нужного гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения нужной ДНК содержит: исследуемую ДНК-матрицу, субстраты реакции – 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную Taq-полимеразу и реакционный буфер (кофактор – Mg2+).
библиотека
материалов
Содержание слайдов
Номер слайда 1

Метод Полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Номер слайда 2

ПЦР – метод амплификации, т.е. получения большого числа копий нужного гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения нужной ДНК содержит: исследуемую ДНК-матрицу, субстраты реакции – 4 д. НТФ, 2 праймера, термостабильную Taq-полимеразу и реакционный буфер (кофактор – Mg2+). В 1983 году Кэри Мюллис с сотрудниками разработал метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Номер слайда 3

Праймеры – это искусственно синтезированные короткие однонитевые ДНК (20 – 30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК. В ПЦР обычно используют 2 праймера, которые комплементарны 3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка на обеих нитях ДНК-матицы соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых фрагментов ДНК. Термостабильные бактерии Termus Aquaticus

Номер слайда 4

Компоненты реакции. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (d. ATP, d. GTP, d. CTP, d. TTP). Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — р. Н, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Номер слайда 5

Номер слайда 6

Для того, чтобы выявить и размножить в имеющейся пробе именно ту последовательность ДНК, которая необходима, нужно знать нуклеотидные последовательности ее концов, для того, чтобы создать к ним комплементарные короткие (18-30 нуклеотидов) фрагменты - праймеры. На рисунке эти известные концы последовательности отмечены синим, а черным - тот фрагмент ДНК, который нужен.

Номер слайда 7

Первая стадия - денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись.

Номер слайда 8

Вторая стадия - отжиг. Температуру снижают, и праймеры соединяются Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей с комплементарными им участками ДНК. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Главный элемент PCR - это многократный тепловой цикл, при котором образец ДНК подвергается воздействию трёх различных температур.

Номер слайда 9

Номер слайда 10

Третья стадия - элонгация Полимераза - это фермент, умеющий достраивать вторую цепь ДНК. Для того, чтобы начать это делать, ей нужен кусочек, где ДНК уже двуцепочечная, в этом качестве и выступает место взаимодействия ДНК с праймером. Полимераза всегда достраивает цепь от 5' к 3'-концу (эти названия связаны с ориентацией сахара дезоксирибозы в цепи; в обычной двуцепочечной ДНК цепи направлены противоположно друг другу: 5'_____________3'3'_____________5'Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C

Номер слайда 11

Теперь в растворе есть четыре слишком длинных цепи ДНК. Две - те, которые были, и две построенные по праймерам. Но если повторить процесс ещё раз, то получится следующая картина: Если изначальные цепи ДНК можно было считать условно бесконечными в обе стороны, то нити, полученные в первом цикле, бесконечны в одну сторону, а со второй ограничены праймером. Когда такие цепи будут взаимодействовать со вторым праймером, будут получаться кусочки, ограниченные с двух сторон. Всего в ПЦР проводят несколько десятков циклов, поэтому абсолютное большинство продукта реакции будет представлять собой короткие нужные последовательности, с которыми уже можно будет производить различные манипуляции, в простейшем случае - разгонять на хроматографе и сравнивать полученные полоски с теми, которые должны были бы получиться, если бы была уреаплазма или кто-то другой.

Номер слайда 12

В начале у нас был раствор с небольшим количеством длинных, полноценных клеточных молекул ДНК. В конце ПЦР мы имеем раствор с огромным количеством размноженных нужных участков, кусочков ДНК Раствор наносят на гель, к гелю прикладывают напряжение. Гель кладут под ультрафиолет и масса одинаковых кусочков ДНК начинает светиться в том месте геля, где собралась. Если собралась — значит в ДНК был участок, соответствующий праймеру, нужный «ген». Если ничего не светится, мутная полоска без четкого участка — значит, нужного участка в ДНК нет. Четвертая стадия - детекция.

Номер слайда 13

Эти этапы повторяются многократно в приборе – амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий нужного фрагмента ДНК. Так, в результате проведения 20 циклов ПЦР анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз. Современный амплификатор Corbett

Номер слайда 14

Современный амплификатор Corbett

Номер слайда 15

Общая схема амплификации изучаемого фрагмента ДНК

Номер слайда 16

Широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции, даже если в пробе содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, венерических заболеваний и т.д. Этот метод имеет большое значение для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях. Определение «вирусной нагрузки» позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов. При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам. Метод ПЦР

Номер слайда 17

Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Такой подход является наиболее информативным при диагностике внутриклеточных паразитов и медленнорастущих микроорганизмов, требующих сложных условий культивирования, например, возбудителей туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis.

Номер слайда 18

В качестве примера для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 н.п. (нуклеотидных пар) мигрирующего элемента IS-986, содержащегося в геноме M. tuberculosis в числе 2 – 8 копий.  Последовательность праймеров: INS1 5' - CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC - 3'INS2 5' - GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA - 3'

Номер слайда 19

среди методов диагностики инфекционных возбудителей ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности и специфичности (для Ампли-Сенс ПЦР-систем – 1000 микроор-мов/1 мл); возможность использования разнообразного клинического материала; возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования;Достоинства метода ПЦР:

Номер слайда 20

повышенная стабильность при транспортировке, т.к. нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде; скорость проведения анализа (иногда < 24 ч.); точное определение этиологии инфекции; определение количества возбудителя, это особенно актуально для условно-патогенных микроорганизмов, которые вызывают патологию только при определенных условиях; проведение контроля за течением инфекционного процесса. С другой стороны, метод ПЦР, как и любой другой тест молекулярной диагностики, во многом зависит от правильности забора и транспортировки исследуемого материала. Достоинства метода ПЦР:

Номер слайда 21

Недостатки метода ПЦР 1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, втечение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод NASBA выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений. 2. Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно - патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR). 3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей.

Номер слайда 22

ПЦР в реальном времени. Принцип метода ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) основан на детекции продуктов амплификации уже в процессе реакции и проведении мониторинга кинетики накопления ампликонов. Это означает, что учет результата ПЦР (числа ампликонов) происходит после каждого цикла амплификации, а не в конце, как при обычной ПЦР. Чем больше в исходной пробе было специфической ДНК, тем раньше и больше увеличится число специфических фрагментов. "ПЦР в реальном времени" (Real-Time PCR) позволяет позволяет осуществлять количественную оценку содержания ДНК в исследуемом материале.

Информация о публикации
Загружено: 8 декабря
Просмотров: 630
Скачиваний: 14
Габрильянц Элеонора Арутюновна
Биология, 11 класс, Презентации
Скачать материал